农杆菌转化法的具体步骤
农杆菌转化法是将外源基因导入植物细胞的关键技术，其核心是利用根癌农杆菌天然的基因转移能力。整个过程可简化为四步。第一步是准备阶段：将含有目的基因的质粒（如T-DNA区插入目标基因）通过电击或冻融法导入农杆菌感受态细胞中。第二步是共培养：将已转化的农杆菌与新鲜的植物外植体（如叶片圆片）在培养基上共同培养1-3天，期间农杆菌会附着于植物伤口，并将T-DNA转入植物细胞核。第三步是筛选与除菌：将外植体转移到含有抗生素（如卡那霉素）和杀菌剂（如头孢霉素）的培养基上。抗生素筛选出成功转入外源基因的植物细胞，杀菌剂则杀死残留的农杆菌。第四步是再生：存活的细胞在分化培养基上诱导形成愈伤组织，进而发育成完整幼苗。
转化结果的检验方式
转化是否成功需要通过多层次的检验来确认。最常用的是报告基因检测法，例如，若载体上带有GUS基因，加入底物X-Gluc后，成功转化的组织会显现蓝色，直观快捷。分子水平的检测则更为精确：通过提取植物DNA进行PCR扩增，若能特异性地扩增出目的基因片段，则初步证明基因已整合；进一步通过Southern杂交可以确认外源基因在植物基因组中的整合情况。此外，还可以通过RT-PCR检测目的基因是否成功转录出mRNA，或通过Western杂交检测其是否翻译出相应的蛋白质，从而全面验证转化是否有效。
综上所述，农杆菌转化法步骤清晰，从准备到再生环环相扣。配合从简单到复杂的系列检验手段，可以高效、可靠地获得转基因植株，是现代植物基因工程的基础工具。