Trizol法提总RNA时氯仿的作用
在分子生物学实验中，Trizol法是一种广泛使用的从细胞或组织中提取总RNA的经典方法。该方法的核心步骤之一，是在加入Trizol试剂并充分匀浆裂解样本后，加入氯仿进行抽提。氯仿在这一过程中扮演着至关重要的角色，其核心作用是实现液相分离，并促使蛋白质与核酸的分离。Trizol试剂中的主要成分苯酚，是一种强烈的蛋白质变性剂，能有效溶解细胞并灭活RNase，但它会使蛋白质、DNA和RNA共同存在于均一的液相中。此时加入氯仿，由于其能降低极性并增加疏水性，可以促使苯酚-水相体系发生分层。
具体而言，加入氯仿并充分涡旋混匀后，溶液会离心形成三层：上层是含有RNA的水相，中间层是变性的蛋白质和基因组DNA，下层是含有苯酚和氯仿的有机相。氯仿在这里起到了几个关键作用：首先，它作为强烈的蛋白质变性剂，与苯酚协同作用，使蛋白质彻底变性、沉淀；其次，它能增加密度差异，促进水相和有机相的清晰分离；最后，氯仿还能帮助溶解并带走脂类物质以及残留的苯酚，从而纯化上层水相中的RNA。这一步操作直接决定了RNA的纯度和完整性，若氯仿抽提不充分，蛋白质污染会严重影响后续实验。
操作要点与注意事项
为了确保氯仿发挥最佳效果，实验操作中需注意几个要点。加入氯仿后必须进行剧烈且充分的涡旋混匀（约15-30秒），以确保样品与有机相完全接触，使蛋白质充分变性。随后进行的离心步骤（通常为4°C，12,000g，15分钟）必须足够，以确保三相清晰分离。最后，在吸取上层水相时务必小心谨慎，切勿触及中间的蛋白层，以免造成污染。总而言之，在Trizol法中，氯仿并非简单的辅助试剂，而是实现RNA选择性分离与纯化的关键化学物质，其作用机制深刻影响了整个RNA提取流程的成败。